发稿时间：2020-06-12 来源：凡默谷
摘要
本文结合近期国内新注册分类和一致性评价的相关技术要求，在《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》和《合成多肽药物质控及杂质谱研究》基础上，对多肽类仿制药研发和一致性评价应重点关注的问题进行了探讨，以期帮助新药研发人员提高申报资料质量。
关键词
多肽; 仿制药; 一致性评价; 研究与开发
正文
随着多肽合成工艺的成熟和药物制剂技术的提高，多肽类药物已成为国内外药物研发公司关注的重点。在2017 年度FDA 批准的46 个新药中，有6 个为多肽类药物［1］，为多肽类药物年批准数量的历史新高，证明多肽类药物开发已进入“快车道”。
我国多肽类药物开发起步较晚，原料药的可及性、高端制剂的技术瓶颈等都制约了多肽类药物的发展。随着重大新药创制专项和生物医药产业“十二五”规划的重点扶持，近几年多肽类药物技术难点有了重大突破，国内多肽类药物申报数量逐渐提高。但由于技术实力差异和多肽类药物开发指导性文件的不完善，申请人递交的申报资料质量参差不齐，部分递交资料存在严重缺陷，影响了此类产品的研制和注册申报。针对上述情况，本作者曾发表2篇文献［2 － 3］，结合国内外相关技术指导性文件，对多肽类药物原料药的合成工艺、质量标准、杂质研究等方面进行了探讨。
本文结合国家药品监督管理局发布的《关于药品注册审评审批若干政策的公告》( 2015 年第230号) 、《关于仿制药质量和疗效一致性评价工作有关事项的公告》( 2017 年第100 号) 、《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求( 征求意见稿) 》等相关政策文件的要求，对已上市多肽类药物存在的问题进行了回顾，并对该类药物在一致性评价、仿制药申请中应关注的问题进行探讨。
1.我国多肽类药物现状
多肽类药物在我国近几年的销售额均保持比较快速的增长态势，其中奥曲肽、生长抑素、曲普瑞林、亮丙瑞林等品种销售额均过亿元。但我国可自主生产的多肽类药物产品初级、附加值低。目前，多数市场前景广阔的药物仍主要依靠进口，如胰高血糖素样肽-1( GLP-1) 类似物等，见表1。
表1 部分列举了2000 年之后在欧、美、中国上市的多肽类药物，在肿瘤、抗感染、糖尿病、免疫等治疗领域有较多的多肽类药物上市。通过对比可见，多数药物在我国的上市时间晚于欧美，部分专利过期且疗效确切的药物，在国内尚无仿制品上市或仅有少数企业仿制生产。
可能存在多种原因:
① 原料药的可及性。目前，国内具备商业化生产高质量多肽原料药能力的企业较少，且具有原料药生产能力企业所生产的原料药多数仅供本公司制剂使用，市场上能购买到药用级别高质量的原料药较少，在源头上限制了多肽类药物的发展。
② 关键制剂技术尚需突破。部分特殊多肽制剂，如缓释微球、脂质体、吸入制剂等剂型，现国内掌握上述制剂核心技术的企业较少，从另一方面制约了该类多肽药物的上市。
③ 研发企业的关注度。由于多肽类药物是介于大分子蛋白药物和小分子化学药物之间的一类特殊药物，其研发、生产均具有一定的特殊难度。国内大多数制药企业未涉猎过此类药物，对该类药物的关注度较低，因此导致仿制数量比小分子化学药物低很多。如化学小分子药物帕瑞西布钠，专利过期后，即有数十个企业申报生产，而多肽类药物特利加压素专利早已过期，目前国内仅有个别仿制药企业获准生产。
国内部分已上市的多肽类药物上市时间较早，近年我国成为ICH 成员国，药品的技术标准与国际接轨，随着我国药品一致性评价工作全面展开，早期上市的多肽类药物可能无法满足一致性评价技术要求，已有生产批准文号的多肽生产企业将面临巨大的挑战。
2.参比制剂的确定
按照我国药监机构发布的法规文件，仿制药品应与参比制剂保持质量和疗效一致。中共中央办公厅、国务院办公厅于2017 年发布《关于深化审评审批制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》，明确要求我国应逐步建立橙皮书制度，明确各药品的参比制剂。
由于仿制药桥接了参比制剂质量控制、安全性有效性信息，申请人在开发多肽仿制药时，应高度重视参比制剂的选择。除了参考《关于发布化学仿制药参比制剂遴选与确定程序的公告》( 2019 年第25号) 以外，还应该对产品在国外上市时制剂处方合理性、临床试验规范性科学性、说明书的权威性等进行全面考察。以注射用缩宫素为例，分享参比制剂选择时在药学方面的一些考虑。
在美国、欧洲和日本上市的缩宫素注射液，均有获得国内参比制剂资格的可能性，如美国App Pharmaceuticals，LLC、欧洲Mylan Products Ltd、日本武田薬品工業株式会社等公司产品。对于仿制注射剂，原则上Q1，Q2 与参比制剂一致，即处方中辅料种类和用量一致; 其次《化学药品注射剂基本考虑( 试行) 》要求，在满足需要的前提下，注射剂所用辅料的种类及用量应尽可能减少。
处方中是否含有乙醇是欧洲、美国、日本上市产品处方组成的主要差别。日本、美国上市产品中不含乙醇，欧洲上市产品中含有乙醇，同时检索发现欧洲近期批准产品中也不含乙醇，因此需对处方中乙醇的作用以及存在必要性进行详细分析，并结合产品上市前临床研究和说明书等信息明确参比制剂。
3.多肽原料药质量
多肽原料药质量控制相对复杂，在《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》和《合成多肽药物质控及杂质谱研究》中阐述了如何结合保护氨基酸质量控制、缩合过程控制、纯化控制、中间体控制等综合实现多肽类药物的质量控制［2 － 3］。
在此需要明确合成多肽药物的过程控制更为重要，是多肽类仿制药申请和一致性评价申请提升质量的重点。在全面研究的基础上，才可能实现对多肽类药物的充分质控，仅靠检测手段可能无法有效评估产品质量，以下分享2 个可能引起多肽类药物质量风险的实例。
对于小分子化学药，合成路线不同造成杂质谱的差异有限，经过相应的分析及研究基本可全面覆盖潜在杂质谱的差异。多肽类药物不同于小分子化学药，其合成路线较多，同一条肽链可以利用固相合成、液相合成、固相液相结合的片段合成等手段制备，即合成路线选择较多，造成工艺杂质与参比制剂存在较大差异。从目前申报资料上看，国内基本采用从C 端到N 端逐步偶联的手段制备，而多数国外原研企业采用固相合成制备多肽片段，再偶联成整条肽链。
暂且不分析合成路线合理性问题，但不同合成路线可能导致杂质谱存在较大差别。以美国药典收载的艾塞那肽为例，尽管药典收载的有关物质分析方法多达3 种，但有部分申请人开发之后仍发现药典收载方法存在不可检出的工艺杂质。药典收载的方法可能主要源于原研品方法，由于仿制企业采用的合成路线不同，所产生的杂质谱不一致。
仅采用药典或原研进口注册标准的有关物质分析方法可能无法全面揭示仿制药杂质水平，进而导致产品质量存在风险。因此，对于多肽类药物需进行详细的杂质谱分析并采用相应的杂质对照品对分析方法的检出能力进行全面验证，仅采用已有的分析方法进行考察，很可能造成杂质漏检等质控缺陷。
对于杂质含量方面，需要注意某些杂质即便满足安全水平范围，但也可能对多肽药物的稳定性存在较大影响。比如，某多肽类药物收载于《中华人民共和国药典》，药典对有关物质的要求为最大未知单杂不得过2.0%。在审评过程中发现按药典收载方法检测，参比制剂主峰后为单一杂质峰，多数国产制剂主峰后存在2 个杂质峰，其中1 个杂质峰与参比制剂杂质峰相对保留时间相同，应该为同一杂质，多出的杂质峰为新增未知杂质。
杂质含量未超过最大未知单杂的控制限度要求。尽管初始杂质水平较低且符合药典要求，但在稳定性考察过程中，新增的未知杂质增长较快，12 个月后已接近控制限度要求，而参比制剂主峰后仍基本维持一个杂质峰。分析该杂质可能是酰胺类水解杂质，在体系内残留的少量杂质可能发生类似“链引发”反应，造成仿制产品的杂质增长水平远高于参比制剂。
4.多肽类药物的结构
结构是基础，如果结构上存在差异，仿制产品的活性可能弱于参比制剂，甚至没有活性。多肽类药物结构确证与小分子药物存在较大差别，可能具有高级结构，常用可以反映多肽药物结构的方法如下。
一级结构确证方法: 可以采用质谱测定其分子量，用质谱结合酶切进行肽序的鉴定，或者采用Edman 降解进行肽序的鉴定。
二级结构确证方法: 多肽二级结构实际上是肽链因氢键而形成的局部结构，研究手段有X-射线单晶衍射、二维NMR、FT-IR 及远紫外CD 等方法。其中X-射线单晶衍射及二维NMR 测的最为准确，但多肽的单晶不易培养，而且不代表溶液中的真实情况，而二维NMR 耗时长、解析困难，并且分析通量低，所以这2 种方法一般用得较少; 目前采用最多的是FT-IR 与远紫外CD 法。
三级结构确证方法: 对于复杂多肽可能有三级结构存在，三级结构研究常用的方法有荧光光谱及近紫外CD 等，其原理是利用芳香氨基酸侧链的微环境变化带来荧光发射光谱和近紫外CD 谱的差异。但该方法目前只能进行定性对比研究，无法进行明确的结构确证，只能作为三级结构研究的参考。
四级结构确证方法: 多肽及蛋白功能性聚集是高级结构的一种反映，它包含两方面信息: 聚集单体的数量和聚集后的空间构象。常用的分析方法包括场流分离、超速离心。
生物活性研究方法: 由于高级结构确证可能存在一定的不确定性，可通过测试生物活性间接证明多肽类药物高级结构的正确性。如表2 所统计已收入美国药典的11 个多肽类药物有4 个制剂和1 个原料药需要测定生物活性，越来越多的多肽类药物需要增加生物活性的研究和检测。
目前，对于多肽及蛋白的活性研究有体外( invitro) 及体内( in vivo) 2 种路径。in vitro 评价方法包括但不限于酶动力学、结合力测定、生物活性测定;其中酶动力学测定采用酶促反应; 结合力测定，如果是分子之间采用表面等离子共振技术( SPR) 、生物膜层干涉技术( BLI) 以及微量差示扫描量热技术( NanoDSC) 等技术完成，如果是和细胞表面的受体结合一般采用均相时间分辨荧光等技术完成; 生物活性一般采用药物刺激细胞，采用均相时间分辨荧光等技术检测其产生的化学物质来完成［4］。in vivo评价一般采用动物或动物器官，如机理明确则检测具体某种化合物指标，如不明确则观察具体的治疗效果。例如可采用小鼠的EAE 模型来评价醋酸格拉替雷对多功能硬化症的症状延迟及减轻效果［5］。
对于多肽类药物而言，结构确证部分不同于小分子化学药物。小分子化学药物一般在原料药部分明确结构后，制剂开发中可不用进一步研究。而多肽药物由于高级结构的不确定性，部分需要在制剂中与参比制剂进行对比研究，以确定某一结构含量与参比制剂的一致性。同时，由于多肽类药物高级结构与其所处环境有关，在结构测试过程中可能脱离药物实际使用环境，因此有必要采用多种相互补充的分析方法对比研究仿制品与参比制剂结构的一致性。
在此需要明确，并不是所有多肽类药物都存在高级结构，在合成中存在高级结构的药物仅占少数。在此建议产品开发者先通过参比制剂信息、文献、专利等方面综合检索，明确是否存在高级结构，再选择适合的结构确证手段进行研究，避免过度开发。
5.多肽制剂研究
多肽类药物制剂绝大多数为注射剂，有少量口服制剂，如去氨加压素、利那洛肽、索玛鲁肽等，有少量吸入制剂如去氨加压素、鲑降钙素等。本文主要结合《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求( 征求意见稿) 》对多肽类药物注射剂与小分子化药存在的潜在差异进行重点讨论。
5.1 处方工艺方面
辅料选择问题: 尽管药监部门允许注射剂仿制药在抑菌剂、缓冲剂、pH 值调节剂、抗氧剂、金属离子络合剂等与参比制剂存在差异，但对于多肽制剂而言，所选择辅料应尽可能与参比制剂一致，主要原因有: 肽链的稳定性较差，酸、碱、金属离子等可能引起肽链降解; 肽类药物结构中存在多个裸露的氨基与羧基，可能会与辅料相互作用，形成相关的杂质; 多肽类药物可能存在高级结构，细微的pH 值、离子强度的差异可能引起结构的变化。
配液过程: 部分多肽类药物对溶液pH 值、氧含量、离子强度等敏感，在配制过程中，短时间脱离稳定环境，会给多肽类药物造成不良影响。对工艺细节的把握则更加关键，需对原辅料加入顺序、搅拌时间、搅拌速度、是否需要避光除氧等进行详细的考察，确定是否对产品质量造成影响。
如某多肽制剂，前期工艺开发过程中发现该药物在相对较窄的pH 值范围内稳定，拟定关键工艺参数pH 值控制范围也相对较窄。在首次工艺验证中发现，配液之后pH 值在拟定控制范围内，但所制备部分终产品pH 值已超出拟定控制范围。主要原因是批量放大后，商业生产设备的搅拌性能低，多肽类药物的溶解时间延长，药物配置后pH 值需在较长时间后达到稳态。对搅拌速度、时间等工艺参数进行详细考察后，实现了连续3 批产品的稳定生产。
如某多肽制剂，3批工艺验证产品在12 个月稳定性留样时，一批产品杂质增加幅度明显较另2 批大，经审查实际批生产记录时发现，变化较大批次产品存在pH 值回调问题。由于该产品工艺是将原料药加入调好pH 值的溶液中，回调之后体系离子强度增加，初步判断是造成该降解现象的主要原因。申请人的补充研究显示，如果体系中离子强度增加，加速试验可明显发现药物降解速度增加，因此在工艺规程中进行了严格的限定，如pH 值调节失败，直接作为废液处理，重新生产。
冻干工艺问题: 多肽类药物受稳定性限制，采用注射给药途径时多选择冻干注射剂。从申报资料来看，多数申请人仅以可冻干为目的开展研究，忽视冻干工艺对稳定性的影响。由于药物在冻干过程中可能存在缓冲剂结晶、pH 值位移、稳定剂形态改变、多肽空间构象改变等诸多问题，进而可直接影响多肽类药物的稳定性。如某进口多肽制剂，拟定冻干工艺需40 ℃保持较长时间，由于药物拟定贮藏条件是2 ～ 8 ℃保存，因此在审评过程中对该过程提出疑问，要求申请人进一步提供冻干工艺的合理性。申请人提供了不同冻干工艺条件下产品稳定性的比较数据，结果显示二次升温阶段采用较高温度时，产品长期放置过程中降解杂质明显少于全程均在低温条件下冻干的产品。该过程可认为是冻干工艺中的“退火”，可以起到释放药物能量、改善微观结构等作用，进而达到进一步稳定多肽类药物的目的。美国Michael Pikal 教授在该方面进行了深入研究［6］，可指导多肽类药物冻干工艺的开发。
特殊包装形式问题: 部分降糖药物采用卡式瓶预灌封技术，该类药物由于制备工艺和使用方法的特殊性，需建立特别的研究手段。如卡式瓶在生产过程中一般需硅化处理，硅化步骤直接影响内壁的光滑程度，进而影响给药剂量的准确性。应对硅油喷涂量、均匀性等进行相应的控制; 由于给药方式的特殊性，如制剂中含有气泡，会导致对压力反应的不一致，直接引起给药剂量不准确，可在灌装过程中采取多次注入的方式以减少气体的引入; 该类药物涉及多次刺穿等问题，需对包材密封性进行完整的考察。
相容性问题: 部分多肽类药物对生产设备可能引入的金属杂质较敏感，微量杂质的引入可能引起肽链降解，导致仿制品的降解速度快于参比制剂。开展药物与生产设备、滤器、药物包材的相容性研究时，在小分子化药关注研究内容的基础上，研究者应提高对金属离子等无机杂质的关注度。另外，多肽类药物给药剂量通常较小，为了保证药物剂量的准确性，需要关注生产设备、滤器、包材对药物的吸附，必要时可采用过量投料的方式予以解决，但应提供充分依据。
如某多肽制剂，申请人在前期开发中发现拟定生产设备可引入金属离子，导致产品降解速率明显加快。由于生产设备更换难度较大，申请人拟定配液工序使用一次性配液袋，避免了金属离子的引入，进而保证了产品质量。
专属溶媒、注射器问题: 部分多肽参比制剂有专属溶媒、专属注射器具，仿制药企业在开展研究时，需要关注药物是否与临床通用配伍溶媒、注射器存在相容性问题，应充分评估专属溶媒、注射器的必要性。
如特利加压素参比制剂，具有专属溶剂氯化钠水溶液，产品质量标准附录中对氯化钠水溶液中氯化钠浓度和pH 值等做了较详细的限定，目前临床通用的配伍溶剂不满足参比制剂拟定控制限度要求。国内上市的注射用特利加压素均未明确临床配伍溶剂，因此在后续一致性评价等研究中需评估专属溶剂的必要性及配伍使用过程中对产品质量及患者耐受性等多方面的影响。
5.2 质量研究方面
研究者应结合多肽药物的自身特点，在质量研究中进行针对性考察。对于稳定性差的多肽类药物，应关注pH 值、性状、复溶时间、初始杂质水平等是否与参比制剂一致。可能会存在质量标准控制限度较宽，仿制品可满足拟定质量标准要求，但与参比制剂相比仍存在一定差异的现象。
研究者应结合多肽药物的自身特点，在质量研究中进行针对性考察。对于稳定性差的多肽类药物，应关注pH 值、性状、复溶时间、初始杂质水平等是否与参比制剂一致。可能会存在质量标准控制限度较宽，仿制品可满足拟定质量标准要求，但与参比制剂相比仍存在一定差异的现象。
有关物质是多肽类药物制剂质量研究的重点项目之一，制剂质量研究应结合原料药有关物质考察结果，关注对降解杂质的考察，需要重点关注聚合物杂质。多肽含有二硫键、裸露的氨基和羧基等，很容易因分子间二硫键或氨基羧基间的脱水形成聚合物。
研究者应明确高分子杂质是由共价键形成的聚合物、分子间力形成的聚集体还是肽链固定的高级结构。如是共价键形成的聚合物，则可能存在较大免疫原性风险，应确定与参比制剂中该杂质的结构一致性，并确保其含量在安全的限度以内。
5.3 稳定性问题
在对多肽类药物开展稳定性考察时，除常规考察项目外，应重点关注配伍稳定性研究，主要原因是多肽类药物多在溶液状态下稳定性较差，配伍稳定性更能体现出与参比制剂的质量差别。部分多肽类药物如按临床实际使用药液浓度，需稀释较大倍数，按拟定质量标准中分析方法可能无法检测出产品真实的质量变化情况。必要时可降低配伍溶液使用量，与参比制剂在相同的配伍浓度下进行稳定性比较，证明仿制品质量不低于参比制剂。
应该重视的是，目前国内上市的部分多肽类仿制药物的贮藏条件比参比制剂更加苛刻，如卡贝缩宫素，参比制剂贮藏条件为不超过30 ℃，不能冻存。国产仿制药贮藏条件为密闭，2～ 8 ℃保存。贮藏条件的差异提示产品的稳定性可能存在差异，进一步探讨可能是由多肽仿制药的原料药、处方、生产工艺、生产设备、包装容器等综合原因所致。上述问题体现仿制药质量未能达到与参比制剂一致，需要提升和改进质量，稳定性应与参比制剂一致，贮藏条件原则上应不比参比制剂苛刻。
6.结语
由于多肽类药物是介于小分子化学药物和蛋白药物之间的一类特殊制剂，尽管研究开发存在一定困难，在对药物风险充分识别的基础上，建立相应的控制措施，可有效保障产品质量。
中国新药杂志 2020 年 第 29 卷 第 8 期 作者 胡玉玺，韩天娇，胡延臣 国家药品监督管理局药品审评中心 北京大学药学院 天然药物及仿生药物 国家重点实验室 声明：引光医药对本文观点保持中立。文章仅供交流学习使用，版权归原作者所有，如遇版权问题请与我们联系（Email：HR@YGMED.CN）
